Efeito Matriz
A ANVISA publicou em 24 de julho de 2017 a RDC no 166, que estabelece os critérios para validação de métodos analíticos empregados em insumos farmacêuticos, medicamentos e produtos biológicos em todas as suas fases de produção (Art. 1º e 2º). O Art. 29 estabelece que o efeito matriz deve ser determinado por meio da comparação entre os coeficientes angulares das curvas de calibração construídas com a Substância Química de Referência (SQR) do analito em solvente e com a amostra fortificada com a SQR do analito.
Em outras palavras, o efeito matriz deve ser determinado por comparação das inclinações das curvas de calibração que relacionam as respostas analíticas com as concentrações do analito em uma amostra. Por exemplo: Absorbância x Concentração.
Veremos nesse artigo como comparar as inclinações de curvas de calibração utilizando o Minitab quando as curvas de calibração são retas.
Inclinação das retas de calibração.
Vejamos o que significa comparar as inclinações das curvas de calibração. O gráfico da Figura 1 apresenta relação entre a resposta analítica (Absorbância) e as variáveis de entrada Matriz e Concentração.
Quando a Concentração está no Nível 1, a mudança da Matriz 1 para a Matriz 2 provoca o aumento D na Absorbância. Quando a Concentração está no Nível 2, a mudança da Matriz provoca o mesmo aumento D . Ou seja, as inclinações das retas são iguais (retas paralelas). Nesse caso, dizemos que as variáveis Concentração e Matriz não têm interação.
No gráfico da Figura 2, quando a Concentração está no Nível 1, a mudança da Matriz 1 para a Matriz 2 provoca o aumento D1 na Absorbância. Quando a Concentração está no Nível 2, a mudança da Matriz provoca um aumento maior: D2 . Ou seja, as inclinações das retas são diferentes (não paralelas). Nesse caso, dizemos que Concentração e Matriz têm interação.
O ideal é o método analítico fornecer o mesmo resultado para as duas matrizes, como mostra a Figura 3. As variáveis Concentração e Matriz não tem interação (retas paralelas) e a mudança da Matriz não muda a posição da curva de calibração (retas coincidentes). Nesse caso, não há o efeito matriz.
Avaliação do Efeito Matriz
Uma maneira de avaliar o Efeito Matriz é aplicar Regressão Linear Múltipla para construir o seguinte modelo:
A multiplicação (Concentração . Matriz) é a interação entre as variáveis Concentração e Matriz. Se os coeficientes b2 e b12 forem iguais a zero, o modelo é reduzido para:
Ou seja, a resposta analítica não depende da Matriz. Portanto, não tem efeito matriz. A avaliação do Efeito Matriz pode ser resumida no diagrama de decisão da Figura 4.
Avaliação do Efeito Matriz no Minitab
Vamos mostrar a comparação das retas de calibração no Minitab com os dados da Tabela 1.
Utilize o comando Estat/Regressão/Regressão/Ajuste de Modelo de Regressão. Inclua as variáveis como mostra a Figura 6: Absorbância em Resposta, Concentração em Preditores contínuos e Matriz em Preditores categóricos.
Aperte o botão “Modelo” para incluir a interação Concentração x Matriz, como mostra a figura 7.
Como resultado, Minitab mostra as equações de regressão das Matrizes A e B.
Agora, devemos testar a hipótese nula de cada coeficiente:
Começamos com o coeficiente da interação:
O Valor-P é igual a 0,512; maior do que 0,05. Logo, o coeficiente da interação não é significativo, ou seja, é igual a zero. Portanto, as inclinações das duas retas de regressão são iguais.
Vejamos o coeficiente da Matriz.
O Valor-P é igual a 0,041; menor do que 0,05. Logo, o coeficiente da Matriz é significativamente diferente de zero e, portanto, a Matriz influencia a resposta analítica.
Podemos ver claramente esses efeitos em um gráfico de dispersão por grupos (Figura 8).
As inclinações das retas não são significativamente diferentes (Valor-P = 0,512 > 0,05) e, portanto, as duas inclinações são iguais. Mas a reta da Matriz B está acima da reta da Matriz A, indicando um efeito constante na Absorbância ao longo de toda a faixa de variação da Concentração.
Uma vez que a interação não é significativa, retiramos a interação do modelo, obtendo as seguintes equações:
Agora, o coeficiente da Concentração (inclinação da reta) é o mesmo nas duas equações.
Conclusão
O Efeito Matriz ocorre quando substâncias presentes na Matriz interfere nas respostas das análises, podendo provocar erros de interpretação dos resultados.
Portanto, avaliar o Efeito Matriz é fundamental para conhecer o grau dessa interferência e, se possível, adotar medidas preventivas.
Apresentamos nesse artigo como avaliar o Efeito Matriz, mas omitimos aspectos importantes da análise dos modelos de regressão (coeficiente de determinação, análise de resíduos e colinearidade). Esses assuntos são apresentados no curso Validação de Métodos Analíticos – RDC no 166.
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